同時，他還提出了他對病原微生物的觀點，他認為每種疾病都有特定的病原菌，而不是像人們之前所認為的，所有細菌都是一個種。科赫的報告引起了微生物學界的震動，這是人們第一次證明一種特定的細菌是引起一種特定傳染病的病因，科赫的報告開啟了科學家們關於病原微生物研究的時代。
發現炭疽桿菌並不是科赫事業的終結，只是他輝煌事業的開端。1880年，科赫應邀赴柏林工作，出任德國衛生署研究員。在這裡，他終於有了良好的實驗設備和研究助手，他創造了至今還在普遍使用的經典細菌培養法—懸滴法，他用不同的染液給細菌染色，給顯微鏡加上了照相機，顯微攝影術的出現讓人們可以透過照片清楚地看到顯微鏡下的世界，終結了僅憑肉眼觀察、文字描述或手繪圖案定義細菌而引發的爭議與混亂。
然而，一個至關重要的問題始終沒有得到解決，人們仍然不知道，應該如何從許多混雜在一起的細菌中分離出純種的細菌。細菌是會活動的生物，當它們在培養液中游走的時候，是幾乎不可能分離出純種細菌的。想明白了這點的科赫知道，只有用固體培養基才能得到純種細菌。他將瓊脂加到了傳統的肉湯培養基中，首創了肉湯瓊脂固體培養基。到今天，這仍然是細菌分離的重要工具。
科赫做了關於純種細菌培養的報告和示範，當時的微生物學權威巴斯德評價道，「這是一項偉大的進展」。
19世紀，肺結核被稱為「白色瘟疫」，在當時的死因中占據前列，可人們無論是對死者進行病理解剖還是動物實驗，都沒辦法找到致病菌。傳統的方法在肺結核面前失去了效果，人們束手無策，只能坐以待斃。
當時有很多科學家為尋找肺結核的致病菌絞盡腦汁，科赫自然也不例外。科赫意識到，特殊的感染一定是由特殊的微生物引起的，只有找到那個微生物，將其分離培養出來，才有進一步研究的可能性。
於是，科赫用各種染料給病灶組織染色，結晶紫、美藍、伊紅、剛果紅⋯⋯常用的染料科赫都試了個遍，卻仍然一無所獲。雖然有些失落，但是科赫沒有放棄尋找合適的染料。終於，在亞甲基藍染色後的組織中，他發現了一種從未見過的細菌。
為了驗證自己的實驗結果，他在柏林的各個醫院中尋找因結核病致死的患者遺體，拿到了大量病灶組織的他繼續著自己的實驗。他將結核組織注射到各種動物體內並進行染色觀察。結果讓他十分興奮，所有患上結核病的動物體內都能看到那種細菌。而健康的動物體內，完全找不到那種細菌的蹤影。
向來嚴謹的科赫並沒有直接宣布自己發現了結核病的致病菌。在實驗中，他給動物注射的是病灶組織提取液，不是純淨的細菌。僅憑病灶組織提取液並不能證明已經發現了結核病的致病菌。他決定將那種細菌分離出來。
